Effet antibactérien de la propolis : expérimentation sur Escherichia coli

Présentation de la propolis

La propolis est une matière fabriquée par les abeilles à base de résine et de leurs secrétions. Elle leur sert principalement de mortier, mais on lui attribue souvent des propriétés antibactériennes. Les vertus de la propolis sont mises en avant par les apiculteurs ainsi que les laboratoires pharmacologiques. S’il faut rester prudent sur des allégations parfois peu étayées, de nombreuses études scientifiques ont néanmoins confirmées l’existence d’un pouvoir bactéricide de la propolis in vitro

Face à cette utilisation croissante dans de nombreux secteurs, il serait intéressant de mesurer l’effet bactéricide de la propolis afin d’en adapter le dosage à l’usage voulu. La difficulté, démontrée par ces études, c’est que la composition de la propolis varie selon la zone géographique de récolte, modifiant l’effet bactéricide.

Nous nous concentrerons sur l’étude de l’effet bactéricide de la propolis récoltée dans le Tarn, sur la commune de Giroussens.

L’effet antibactérien de la propolis du sud de la France est-elle fonction de la dose utilisée ?

Nous faisons l’hypothèse d’une corrélation entre l’efficacité de la propolis contre les bactéries et la quantité de propolis utilisée.
Pour valider ou non cette hypothèse nous allons observer l’évolution de l’inhibition bactérienne en fonction de la quantité de propolis utilisée.
Nous effectuerons nos expériences sur la bactérie Escherichia Coli, une bactérie gram négatif très commune chez l’être humain (flore intestinale ). Bien que notre problématique ne vise pas spécifiquement à tester la propolis sur cette bactérie, nous ne pourrons, quelques soient les résultats, généraliser nos conclusions à l’ensemble des bactéries car il se peut que chaque bactérie se comporte différemment envers la propolis.

Détermination de la concentration en propolis minimale nécessaire

Pour déterminer une concentration minimale inhibitrice, l’utilisation d’un « antibiogramme liquide » ne s’est pas avérée concluante à cause de la trop grande absorbance de la propolis.
La propolis est une substance naturelle capable d’inhiber le développement d’une colonie de bactéries et peut donc être considérée à juste titre comme un antibiotique. Or l’antibiogramme permet de tester et comparer l’efficacité d’antibiotiques sur une population bactérienne. De ce fait nous avons initialement choisi cette technique expérimentale afin de comparer l’efficacité du pouvoir d’inhibition bactérienne de la propolis.
Selon certains articles scientifiques, trouver une CMI (concentration minimale qui inhibe la croissance bactérienne) est un moyen pour montrer que la propolis agit contre les bactéries et que cette action peut varier selon sa quantité. Nous avons donc pensé à utiliser des solutions plus ou moins concentrées en propolis et à déterminer celles qui témoignent de son action antibactérienne.

La propolis ne peut être utilisée qu’après avoir été diluée dans de l’éthanol

Pour un antibiogramme, il faut que l’antibiotique soit sous forme liquide. Or la propolis est solide à température ambiante. Elle est majoritairement composée de substances hydrophobes telles des résines et des cires. Il est donc nécessaire d’utiliser un solvant puissant si l’on souhaite la diluer. Le plus commun étant l’éthanol, nous l’avons sélectionné afin de nous rapprocher des conditions réelles.
Nous avons choisi de pratiquer la dilution en ajoutant des masses d’eau, d’éthanol et de propolis (on n’utilise pas ici la table de Gay-Lussac pour la dilution conventionnelle de l’éthanol).

Afin de pouvoir diluer des quantités de propolis plus importantes, nous avons laissé la dilution se poursuivre pendant environ 21 jours, à température ambiante, en agitant régulièrement les solutions afin de faciliter le processus.
Pour terminer nous avons filtré les différentes solutions de manière à éliminer la propolis solide résiduelle.

Conclusions sur la pertinence de l’antibiogramme liquide avec la propolis

La réalisation d’un « antibiogramme liquide » ne permet pas de connaître la concentration minimale inhibitrice à cause de la trop grande absorbance de la propolis

La propolis est mise en contact avec les bactéries pendant 24h

Après une mise en culture sur milieu gélosé dans une boite de pétri, les bactéries sont prélevées et mises en solution dans l’eau de manière à obtenir une « concentration » bactérienne correspondant à un Mc Farland 0,5.
On ajoute ensuite dans des tubes à hémolyse de 20ml, 10ml de solution de propolis diluée ainsi qu’un volume équivalent de suspension bactérienne.
On remarquera que lors de la mise en contact des deux solutions qui étaient jusque-là assez limpides, un trouble jaunâtre important se forme.
Suite à cela, les tubes sont mis dans des étuves à 37°C pendant 24h.

La mesure de la concentration en bactéries se fait par spectroscopie

En milieu liquide, le dénombrement des bactéries aurait pu se faire par comptage à l’aide de microscopes, cependant cette technique, prenant beaucoup de temps, n’était pas adapté à notre emploi du temps.
Nous avons donc décidé de procéder par spectroscopie classique; c’est à dire d’effectuer des mesures d’absorbance à l’aide d’un spectrophotomètre de manière à quantifier le trouble de nos solutions. Afin de déterminer une longueur d’onde optimale de mesure nous voulions faire les premières mesures tous les 50nm de 400 à 800nm.

Les solutions sont trop troubles pour que l’on puisse effectuer les mesures

Sur l’ensemble des 7 échantillons, nous n’avons pu mesurer l’absorbance que pour le témoin, les autres solutions étaient trop troubles pour que l’on puisse en mesurer l’absorbance avec le matériel à notre disposition. Il aurait pu en effet être intéressant de procéder à des mesures dans l’ultraviolet ou l’infrarouge.

Après un entretien avec Mme Genthon, professeur de microbiologie, il s’est avéré que la quantité d’éthanol utilisée (> 50%) était bien trop élevée pour que les bactéries survivent, ce qui ne permettait donc pas d’observer l’inhibition de la croissance bactérienne par la propolis. Nous nous sommes donc tournés vers la technique de l’antibiogramme sur milieu gélosé, qui fait intervenir une plus faible quantité d’alcool et qui permet à ce dernier de s’évaporer et donc de limiter son effet.

L’antibiogramme sur gélose aurait dû nous permettre de comparer l’activité antibactérienne de la propolis en fonction de sa quantité

Pour de faibles quantités de propolis on n’observe pas de cercles d’inhibition de la croissance bactérienne. Les bactéries sont mises en contact avec la propolis pendant 24h.
Nous avons réalisé le protocole classique d’un antibiogramme sur gélose nutritive:

Nous avons utilisé les différentes solutions de propolis diluées (I,A) et plus particulièrement les moins concentrées :

On mesure les cercles d’inhibition de la croissance bactérienne

Dans le principe de l’antibiogramme, un antibiotique est d’autant plus efficace que son cercle d’inhibition de la croissance bactérienne est grand (mesure du diamètre). Or ici la présence de cercles d’inhibition parait aléatoire.

Les résultats sont inexploitables, probablement à cause d’une trop faible quantité de propolis utilisée

On suppose que les résultats sont ici non-quantifiables du fait d’une trop faible quantité de propolis utilisée. De plus, après l’écouvillonnage, les bactéries n’étaient pas réparties sur l’ensemble de la boite et de nombreux disques imbibés se sont retrouvés sur des zones ne comprenant pas de bactéries : ils étaient donc inexploitables.
En outre, les rares traces d’inhibition ne formaient pas des cercles, mais des « taches » dont la mesure du diamètre n’était pas efficace.
Il serait donc intéressant de tester les solutions contenant plus de propolis et de mesurer des surfaces et non des diamètres pour plus de précision.

L’utilisation d’une plus grande quantité de propolis couplée à la méthode de l’antibiogramme sur gélose permet d’observer des cercles de lyse

Grâce à l’amélioration du protocole, on observe des cercles de lyse

Il nous a semblé logique que l’utilisation d’une plus grande quantité de propolis permette d’observer plus aisément des cercles de lyse de taille plus importante. De plus nous avons optimisé et acquis de l’expérience dans nos manipulations : nous avons par exemple pris soin d’imbiber de façon homogène chacun des disques, ce qui permet de réduire les erreurs liées aux manipulations et d’obtenir des résultats plus précis.
Nous avons également écouvillonné les boites sur toute leur surface de manière à être certains de déposer les disques imbibés sur des bactéries.

Nos résultats témoignent de l’activité antibactérienne de la propolis….

Les 15 antibiogrammes réalisés nous permettent d’obtenir des séries de 15 données pour chaque quantité de propolis utilisée.
Nous avons choisi de ne garder pour chaque série (correspondant à une quantité de propolis) que les valeurs comprises entre la moyenne moins l’écart-type et la moyenne plus l’écart-type. Ainsi nos valeurs restent comprises dans un intervalle qui nous semble cohérent et qui écarte les valeurs extrêmes qui pouvant être induites par des erreurs de manipulation.

On peut constater que les plus faibles valeurs des séries 1,2,3 et 4 ne recoupent pas la plus haute valeur prise par le témoin : on peut donc dire que la propolis a bel et bien un effet antibactérien.

Cependant nous n’observons pas de corrélation entre la quantité de propolis utilisée et son efficacité

En effet l’hypothèse selon laquelle l’efficacité de la propolis sur les bactéries serait proportionnelle à sa quantité ne peut pas être validée : nos résultats ne témoignent d’aucune corrélation de ce type.
Pour chacune des 4 solutions contenant de la propolis, les valeurs restent majoritairement comprises entre 0,35 et 0,56 cm². Bien qu’en moyenne il semble que la solution 2 soit la plus efficace, ce résultat n’est pas significatif car il n’est pas confirmé si l’on prend en compte l’ensemble des valeurs (voir image 5).

Conclusion sur les propriétés antibactériennes de la propolis

Nos expériences ont pris différentes formes au cours de l’année et ne se sont pas toutes montrées concluantes. Un antibiogramme liquide était inadapté et notre première utilisation de l’antibiogramme sur gélose ne nous à pas permis d’obtenir des résultats. En supposant que cela provienne d’erreurs de manipulation, nous avons amélioré notre protocole et réitéré l’expérience à l’aide d’antibiogrammes sur gélose. Cette fois ci nous avons obtenu des résultats que l’on a tenté d’interpréter. A la vue de ces derniers, nous ne pouvons valider notre hypothèse : nous n’avons pas observé de corrélation entre la quantité de propolis et son efficacité contre les bactéries. Nous avons seulement pu constater que la propolis à un effet inhibiteur sur la croissance bactérienne.
Il faut également rappeler que nous n’avons testé la propolis que sur une bactérie, l’interprétation de nos résultats concerne donc uniquement E.Coli. Il aurait été intéressant de pouvoir comparer l’action de la propolis sur d’autres bactéries, voir sur d’autres micro-organismes. Des études ont d’ailleurs montré, par exemple, que le Staphylocoque doré est particulièrement sensible à la propolis.

On peut aussi noter que la composition de la propolis varie en fonction de l’environnement des abeilles et que l’utilisation d’une propolis d’origine différente aurait également pu nous apporter d’autres résultats.
Enfin, bien que cela dépasse le cadre de notre recherche, il est intéressant de se demander quels sont les mécanismes mis en jeu et par quels moyens la propolis inhibe la croissance bactérienne.
Il s’avère que ces processus sont relativement méconnus, mais que certaines hypothèses émergent, il se pourrait que la propolis détruise les parois bactériennes .